Berdasarkan protein dan struktur serta fungsinya, pemahaman fenomena kehidupan pada tingkat molekuler telah menjadi arah utama pengembangan biologi modern. Untuk mempelajari protein, pertama-tama kita harus memperoleh zat target yang sangat murni dan aktif secara biologis. Persiapan protein melibatkan berbagai aspek fisika, kimia, dan biologi, tetapi prinsip dasarnya tidak lebih dari dua aspek. Salah satunya adalah menggunakan perbedaan laju distribusi beberapa komponen dalam campuran untuk mendistribusikannya ke dalam dua atau beberapa fase yang dapat dipisahkan dengan metode mekanis, seperti penggaraman, ekstraksi pelarut organik, kromatografi dan kristalisasi, dll.; yang kedua adalah Campuran ditempatkan dalam satu fase, dan komponen didistribusikan ke area yang sama melalui aksi medan gaya fisik untuk mencapai tujuan pemisahan, seperti elektroforesis, ultrasentrifugasi, ultrafiltrasi, dll. Dalam penerapan semua metode ini, kehati-hatian harus dilakukan untuk menjaga integritas makromolekul biologis dan mencegah hilangnya aktivitas biologis zat yang diusulkan yang disebabkan oleh asam, alkali, suhu tinggi, dan efek mekanis yang parah. Persiapan protein secara umum dibagi menjadi empat tahap berikut: pemilihan bahan dan pra-perlakuan, disrupsi sel dan pemisahan organel, ekstraksi dan pemurnian, konsentrasi, pengeringan dan pengawetan. Mikroorganisme, tumbuhan dan hewan semuanya dapat digunakan sebagai bahan baku untuk menyiapkan protein, dan bahan yang dipilih terutama ditentukan berdasarkan tujuan percobaan. Untuk mikroorganisme, perhatian harus diberikan pada fase pertumbuhannya. Dalam fase pertumbuhan logaritmik mikroorganisme, kandungan enzim dan asam nukleat tinggi, dan hasil yang tinggi dapat diperoleh. Ada dua situasi saat menggunakan mikroorganisme sebagai bahan: (1) Sekresi sel mikroba harus menggunakan Metabolit dan enzim ekstraseluler dalam media kultur; (2) Memanfaatkan zat biokimia yang terkandung dalam bakteri, seperti protein, asam nukleat dan enzim intraseluler. Bahan tanaman harus dikupas dan dihilangkan lemaknya, dan perhatian harus diberikan pada varietas tanaman yang berbeda dan kondisi pertumbuhan dan perkembangan. Jumlah makromolekul biologis yang terkandung di dalamnya sangat bervariasi, dan terkait erat dengan musim. Untuk jaringan hewan, jaringan organ yang kaya akan bahan aktif harus dipilih sebagai bahan baku, dan harus dicincang dan dihilangkan lemaknya terlebih dahulu. Selain itu, bahan yang telah diolah terlebih dahulu harus dibekukan dan disimpan jika tidak segera digunakan untuk percobaan, dan bahan segar harus digunakan untuk menyiapkan biomakromolekul yang mudah terurai. Pemisahan dan pemurnian protein 1. Ekstraksi protein (termasuk enzim) Sebagian besar protein larut dalam air, garam encer, asam encer atau larutan alkali, sementara sejumlah kecil protein yang terikat pada lipid larut dalam pelarut organik seperti etanol, aseton, butanol dan sebagainya. Oleh karena itu, pelarut yang berbeda dapat digunakan untuk mengekstraksi, memisahkan, dan memurnikan protein dan enzim. (1) Metode ekstraksi larutan air. Larutan air garam encer dan sistem penyangga memiliki stabilitas yang baik dan kelarutan yang tinggi untuk protein. Ini adalah pelarut yang paling umum digunakan untuk mengekstraksi protein. Dosis yang biasa adalah 1-5 kali volume bahan baku. Pengadukan yang seragam diperlukan selama ekstraksi untuk memfasilitasi Pembubaran protein. Suhu ekstraksi bergantung pada sifat bahan aktif. Di satu sisi, kelarutan sebagian besar protein meningkat seiring dengan suhu. Oleh karena itu, suhu tinggi mendorong pembubaran dan memperpendek waktu ekstraksi. Namun di sisi lain, peningkatan suhu akan mendenaturasi dan menonaktifkan protein. Oleh karena itu, berdasarkan pertimbangan ini, operasi suhu rendah (di bawah 5 derajat) umumnya digunakan saat mengekstraksi protein dan enzim. Untuk menghindari degradasi selama ekstraksi protein, inhibitor enzim proteolitik (seperti diisopropil fluorofosfat, asam iodoasetat, dll.) dapat ditambahkan.
Konsentrasi, pengeringan dan pengawetan 1. Konsentrasi sampel Selama proses persiapan makromolekul biologis, sampel menjadi sangat encer karena pemurnian kolom. Untuk tujuan pengawetan dan identifikasi, konsentrasi sering diperlukan. Metode konsentrasi yang umum digunakan: 1. Dekompresi dan pemanasan penguapan konsentrasi menurunkan titik didih cairan dengan mengurangi tekanan permukaan cairan. Semakin tinggi derajat vakum dekompresi, semakin rendah titik didih cairan turun dan semakin cepat menguap. Metode ini cocok untuk beberapa pasien yang tidak toleran Konsentrasi makromolekul biologis panas. 2. Aliran udara menguap dan berkonsentrasi. Aliran udara dapat mempercepat penguapan cairan, dan menyebarkan larutan menjadi lapisan tipis, dengan aliran udara terus-menerus melewati permukaan; atau masukkan larutan makromolekul biologis ke dalam kantong dialisis dan letakkan di ruangan dingin, dan gunakan kipas untuk meniupkan udara. Pelarut yang melewati membran tidak menguap untuk mencapai tujuan konsentrasi. Metode ini memiliki kecepatan konsentrasi yang lambat dan tidak cocok untuk mengonsentrasikan sejumlah besar larutan. 3. Metode pembekuan: makromolekul biologis membeku menjadi es pada suhu rendah. Garam dan makromolekul biologis tidak memasuki es tetapi tetap dalam fase cair. Selama operasi, larutan yang akan dikonsentrasikan terlebih dahulu didinginkan untuk mengubahnya menjadi padatan, dan kemudian dicairkan perlahan-lahan. Perbedaan antara titik leleh pelarut dan zat terlarut digunakan untuk mencapai tujuan menghilangkan sebagian besar pelarut. Misalnya, ketika larutan garam protein dan enzim dikonsentrasikan dengan metode ini, kristal es murni tanpa protein dan enzim mengapung di permukaan cairan, dan protein dan enzim terkonsentrasi dalam larutan yang lebih rendah. Dengan menghilangkan es batu bagian atas, konsentrasi protein dan enzim dapat diperoleh. cair. 4. Metode penyerapan: Molekul larutan dalam larutan dikumpulkan secara langsung melalui penyerap untuk mengonsentrasikannya. Penyerap yang digunakan tidak boleh bereaksi secara kimia dengan larutan, tidak boleh menyerap makromolekul biologis, dan mudah dipisahkan dari larutan. Penyerap yang umum digunakan meliputi polietilen glikol, polivinil pirolidon, sukrosa, dan gel. Saat menggunakan penyerap polietilen glikol, pertama-tama masukkan larutan makromolekul biologis ke dalam kantong membran semipermeabel, dan tambahkan polietilen glikol. Saat ditutup dengan alkohol dan ditempatkan pada suhu 4 derajat Celcius, pelarut yang merembes keluar dari kantong akan cepat diserap oleh polietilen glikol. Setelah polietilen glikol jenuh dengan air, maka harus diganti dengan yang baru hingga volume yang dibutuhkan tercapai. 5. Ultrafiltrasi Ultrafiltrasi adalah metode yang menggunakan membran khusus untuk menyaring secara selektif berbagai molekul zat terlarut dalam suatu larutan. Saat cairan melewati membran di bawah tekanan tertentu (tekanan nitrogen atau tekanan pompa vakum), pelarut dan molekul kecil yang melewatinya, makromolekul diblokir dan ditahan. Ini adalah metode baru yang dikembangkan dalam beberapa tahun terakhir. Metode ini paling cocok untuk konsentrasi atau desalinasi makromolekul biologis, terutama protein dan enzim. Metode ini berbiaya rendah, mudah dioperasikan, kondisi ringan, dan dapat dirawat dengan lebih baik. Metode ini memiliki keunggulan aktivitas makromolekul biologis yang tinggi dan tingkat pemulihan yang tinggi. Kunci penerapan ultrafiltrasi adalah pemilihan membran. Berbagai jenis dan spesifikasi membran memiliki parameter yang berbeda seperti laju aliran air dan nilai batas berat molekul (yaitu, nilai berat molekul minimum molekul yang dapat ditahan oleh membran), dan harus dipilih sesuai dengan kebutuhan kerja. Selain itu, bentuk perangkat ultrafiltrasi, komposisi dan sifat zat terlarut, konsentrasi larutan, dll. semuanya memiliki dampak tertentu pada efek ultrafiltrasi. Tabung serat berongga terbuat dari membran ultrafiltrasi, dan banyak tabung seperti itu dikumpulkan menjadi satu bundel. Kedua ujung tabung dihubungkan ke penyangga berkekuatan ionik rendah sehingga penyangga terus mengalir di dalam tabung. Tabung serat kemudian direndam dalam larutan protein yang akan didialisis. Ketika penyangga mengalir melalui tabung serat, molekul kecil dapat dengan mudah berdifusi melalui membran, tetapi molekul besar tidak bisa. Ini adalah metode dialisis filtrasi serat. Karena area dialisis yang meningkat, waktu dialisis dipersingkat 10 kali. 2. Pengeringan: Untuk mencegah kerusakan dan memudahkan penyimpanan, produk yang dibuat dari makromolekul biologis sering kali perlu dikeringkan. Metode yang paling umum digunakan adalah pengeringan beku dan pengeringan vakum. Pengeringan vakum cocok untuk mengeringkan dan mengawetkan zat yang tidak tahan terhadap suhu tinggi dan rentan terhadap oksidasi. Selain prinsip pengering, kondensor, dan pengeringan vakum, seluruh perangkat juga menambahkan faktor suhu. Di bawah tekanan yang sama, tekanan uap air berkurang saat suhu menurun, sehingga pada suhu rendah dan tekanan rendah, es mudah menyublim menjadi gas. Selama operasi, cairan yang akan dikeringkan umumnya dibekukan terlebih dahulu di bawah titik beku untuk mengubahnya menjadi padat, kemudian pelarut diubah menjadi gas pada suhu rendah dan tekanan rendah dan dihilangkan. Produk yang dikeringkan dengan metode ini memiliki keunggulan kelonggaran, kelarutan yang baik, dan mempertahankan struktur alami, dan cocok untuk mengeringkan dan mengawetkan berbagai makromolekul biologis. 3. Penyimpanan Stabilitas makromolekul biologis terkait erat dengan metode penyimpanan. Produk kering umumnya relatif stabil, dan aktivitasnya dapat tetap tidak berubah selama berhari-hari atau bahkan bertahun-tahun pada suhu rendah. Persyaratan penyimpanannya sederhana, asalkan sampel yang sudah dikeringkan ditempatkan dalam desikator (berisi bahan pengering) dan disegel, serta disimpan pada suhu 0-4. Hal-hal berikut harus diperhatikan saat menyimpan cairan: 1. Sampel tidak boleh terlalu encer. Sampel harus dipekatkan hingga mencapai konsentrasi tertentu sebelum dapat dikemas dan disimpan. Sampel yang terlalu encer dapat dengan mudah mendenaturasi makromolekul biologis. 2. Umumnya, bahan pengawet dan penstabil perlu ditambahkan. Bahan pengawet yang umum digunakan meliputi toluena, asam benzoat, kloroform, timol, dll. Bahan penstabil yang umum digunakan untuk protein dan enzim meliputi pasta amonium sulfat, sukrosa, gliserol, dll. Untuk enzim, substrat dan koenzim juga dapat ditambahkan untuk meningkatkan stabilitasnya. Selain itu, larutan seperti kalsium, seng, dan asam borat juga memiliki efek perlindungan tertentu pada enzim tertentu. Makromolekul asam nukleat umumnya disimpan dalam larutan penyangga standar natrium klorida atau natrium sitrat. 3. Persyaratan suhu penyimpanan rendah, sebagian besar disimpan dalam lemari es sekitar 0 derajat, dan beberapa memerlukan suhu yang lebih rendah, tergantung pada zat yang berbeda.